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创新 STED 超分辨技术应用于病毒学研究



病毒颗粒大小会随不同病毒种类的 不同而不同。目前已知最小病毒大小约为 1nm;最大为20nm,衣壳大小高达500  nm,此大小几乎与细菌相当 (图1.不同病毒颗粒大小与不同成像技术分辨率的比较)。



以冠状病毒疾病(COVID-19)为例, 其基因组大小在26,000至32,000个碱基对之间,是基因组规模最大的一类RNA病毒。在电子显微镜下呈球状或椭圆形,上有规则排列的囊状胶原纤维突,形似皇冠状,因此得名。该病毒囊膜由双层脂质组成,穿插膜蛋白和纤突蛋白,某些还会有血凝素。病毒内部为RNA和衣壳蛋白组成的核蛋白核心,呈螺旋式结构。此病毒进入人体细胞后,病毒会脱掉外壳将核糖核酸(RNA)基因组释放到细胞质中。冠状病毒的RNA基因组有5'甲基化的端帽和3'多聚腺苷酸化的尾。 这使它可以附着在人类的核糖体上进行转译。



另一方面, 传统荧光显微镜技术,特别是共聚焦荧光显微镜法,可以生成具有更高对比度的荧光图像,并带有针对靶向蛋白质的特异性标记。 但是,这些技术的分辨率仅限于阿贝光学绕射障碍, 解析仅达光波长的一半(~200 nm)。超分辨率显微镜技术 (Superresolution ),特别是STED显微镜技术和单分子定位显微镜技术,可通过利用荧光染料的开关机制来克服了光学分辨率障碍。这些技术将共聚焦分辨率再度提高了大约10倍以上,从而实现了更接近电镜提供的分辨率(见图1)。

Abberior STED的优势:
•结合许多创新的光学技术, 具有实现超高分辨率的STED纳米成像显微镜系统是目前观察细胞和病毒中最精细结构细节的强大技术
•它涵盖了即使在现实环境中以及与宿主细胞相互作用下研究病毒所需的全分辨率光谱
•MINFLUX将开启病毒成像的全新途径


蛋白质特异性荧光标记与光学显微镜的高对比度成像相结合,可以对不同蛋白质进行共定位研究(colocalization),以阐明例如病毒与宿主之间的相互作用。然而 ,在常规显微镜下,我们对蛋白质位置的理解因光学绕射极限而模糊。
STED显微镜特别适合这些研究,因为无论是在横向或是轴向上都能有效地提高分辨率,且无需进行任何后处理(即为RAW-DATA,真实影像),就可以达到60 nm的各向同性分辨率。如果使用了两种光谱不同的染料(它们都可以被同一个STED激光甜甜圈耗尽)(例如STAR ORANGE和STAR RED或Alexa594和ATTO647N),则两个通道之间不会产生色差,由于STED甜甜圈的中心零点定义了从其发射光子的点。

2.共聚焦&STED显微镜进行共定位研究(colocalization)分辨率差异



图3.MINFIELD STED呈现在人免疫缺陷病毒1型(HIV-1标记的Gag蛋白基质和衣壳之间SNAP-标定和染色Siliconrhodamine)
 
(A)      共聚焦(左)和MINFIELD STED(右)视野尺寸为160 nm
(B)       未成熟的HIV-1颗粒的方案,标签以红色表示
(C)       单个HIV-1颗粒的成像实例

 
活细胞成像和随时间推移追踪动态目标的可能性是荧光显微镜相较于EM的一个巨大优势,而Abberior STED显微镜将这种优势与纳米级分辨率完美地结合在一起 。活细胞STED显微镜的主要关注点是漂白和光毒性;尽管可以通过使用耐光染料或可交换的荧光团来克服漂白,但将光毒性降至最低的方法并不那么简单;使用STED显微镜,常常会忽略分辨率和激光功率之间的相互依赖关系。


Abberior 拥有 脉冲STED 的独家专利新技术自适应(智能)光调控技术(例如MINFIELDDyMIN RESCue),可以在低光子下呈现更高分辨率,进而延长成像时间和样品寿命,从而减少光毒效应。关于HIV-1成像的示例如图3所示。在此 ,还需要注意的是,由于病毒颗粒仅包含少量蛋白质,因此仅包含标记,自适应( 智能)光调控技术有助于最大程度地减少光毒害,避免光漂白,从而使人们能够以更高的分辨率成像,或者在实时实验中获得的成像时间更长。




图4. 单个HIV-1颗粒(绿色)上的Env蛋白分布(红色/黄色)。 Vpr.eGFP被用作HIV-1颗粒的标记。 病毒颗粒表面上的Env簇用STAR635P的Fab片段标记。只有使用超高分辨率显微镜才能显示单个Env簇(比较中间列(STED)和右列(共聚焦)) Jakub Chojnacki的图片(经许可使用)。


特定罕见结构或交互作用(例如细胞感染或病毒颗粒结合进入细胞或细胞核)的鉴定是 STED 显微镜的理想目标。
 
由于每个 STED 显微镜本质上都是共聚焦显微镜( 关闭了 STED 激光),因此可以使用低倍物镜在共聚焦模式下扫描样品,以轻松识别目标。找到目标后,可以选择感兴趣的区域并且打开 STED 激光器以获取超分辨率图像;HIV感染核孔附近细胞后衣壳阳性结构的成像就是如何使用 STED 显微镜研究罕见目标的一个良好例子。

 
涉及病毒成像的科学研究需要大范围的成像,从盖玻片上的单个病毒颗粒到整个被感染的细胞,甚至是完整的活小鼠,观察淋巴结的免疫反应。因此,理想的超分辨率显微镜需要灵活地执行所有给定的成像任务。 Abberior STED 显微镜可以可靠地满足这一需求,并且可以适应各种成像实验,超分辨率显微镜的潜力远远超出了 STED。
 
MINFLUX 的新技术提供了高达 2nm 的各向同性分辨率,即单个荧光分子的大小。STED 显微镜已经能够改变我们观察病毒颗粒的方式,因此,不可低估MINFLUX 对科学研究的影响。这种新的分辨率有望对病毒学研究产生巨大影响。 MINFLUX 的追踪以真正的分子精度和极高的速度执行 ,从而观察单个蛋白质随时间的内部重组 ,或者长时间以前所未有的精确度和速度追踪单个病毒颗粒。

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